如何高效提取血液miRNA

刘倩倩

操作步骤

1. 请准备：无水乙醇、1.5mL RNA-Free 离心管。
2. 取出洗涤液，按 85%比例加入无水乙醇， 1.5mL 加入 8.5mL 无水乙醇，充分混匀。
3. 取 1.5mLRNase-free 灭菌离心管，加入 160μL 血液样本，再加入 30μL 结合液及 30μL 消化液，振荡混匀，65℃水浴 12 分钟。
4. 加入 0.22mL miRNA 释放剂 ，充分振荡混匀，室温放置 2 分钟；
5. 13,000rpm 离心 5 分钟，将 400uL 上清液转移到 1 支新的 1.5mL RNA-Free 离心管（注意不要吸到管壁和管底的血迹）；
6. 向上清中加入 5uL miRNA 富集剂，再加入 300 uL 无水乙醇，充分混匀，静置 2 分钟；
7. 将吸附柱放入收集管内，将上述溶液转入吸附柱内，13,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。
8. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液至吸附柱内，静置 2 分钟，13,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。
9. 重复步骤 8。
10. 按每份样本 30μL 取洗脱液（如 10 份提取样本，即取 300μL 洗脱液），放置于灭菌 RNA-Free 离心管，65℃预热。
11. 将吸附柱放回收集管内，13,000 rpm 离心 2 分钟，离去残留的乙醇。
12. 取出吸附柱，放入新的 1.5mL RNA-Free 离心管，开盖放置 2 分钟，挥发乙醇。
13. 加入 30 μL 预热的洗脱液，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，收集 miRNA 溶液。
注意事项：
1.裂解液含有刺激性化学物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。
2.由于 RNA 容易降解，提取实验所用器具应除去 RNA 酶，实验过程中最好戴一次性洁净手套、口罩，提取的 RNA 溶液可适当加入 RNA 保护因子（一般50μL RNA 溶液加入 2μL。）
3.洗涤液加入乙醇后要充分混匀，最好现用现配，每次根据所要提取的样本量计算后适量配制。