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如何高效提取血液miRNA

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发表于 2023-4-21 09:46:37 | 显示全部楼层 |阅读模式
操作步骤

1. 请准备:无水乙醇、1.5mL RNA-Free 离心管。
2. 取出洗涤液,按 85%比例加入无水乙醇, 1.5mL 加入 8.5mL 无水乙醇,充分混匀。
3. 取 1.5mLRNase-free 灭菌离心管,加入 160μL 血液样本,再加入 30μL 结合液及 30μL 消化液,振荡混匀,65℃水浴 12 分钟。
4. 加入 0.22mL miRNA 释放剂 ,充分振荡混匀,室温放置 2 分钟;
5. 13,000rpm 离心 5 分钟,将 400uL 上清液转移到 1 支新的 1.5mL RNA-Free 离心管(注意不要吸到管壁和管底的血迹);
6. 向上清中加入 5uL miRNA 富集剂,再加入 300 uL 无水乙醇,充分混匀,静置 2 分钟;
7. 将吸附柱放入收集管内,将上述溶液转入吸附柱内,13,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
8. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液至吸附柱内,静置 2 分钟,13,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
9. 重复步骤 8。
10. 按每份样本 30μL 取洗脱液(如 10 份提取样本,即取 300μL 洗脱液),放置于灭菌 RNA-Free 离心管,65℃预热。
11. 将吸附柱放回收集管内,13,000 rpm 离心 2 分钟,离去残留的乙醇。
12. 取出吸附柱,放入新的 1.5mL RNA-Free 离心管,开盖放置 2 分钟,挥发乙醇。
13. 加入 30 μL 预热的洗脱液,静置 2 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,收集 miRNA 溶液。
注意事项:
1.裂解液含有刺激性化学物质,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻。
2.由于 RNA 容易降解,提取实验所用器具应除去 RNA 酶,实验过程中最好戴一次性洁净手套、口罩,提取的 RNA 溶液可适当加入 RNA 保护因子(一般50μL RNA 溶液加入 2μL。)
3.洗涤液加入乙醇后要充分混匀,最好现用现配,每次根据所要提取的样本量计算后适量配制。
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