Nature | 内脏疼痛和焦虑？肠道内分泌细胞是关键驱动因素！

朝暮青丝

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胃肠道不适是大多数肠道疾病的标志，是慢性内脏疼痛的重要组成部分。对于很多肠易激综合症患者来说，在组织损伤消失后，胃肠道超敏反应和疼痛仍会持续很长时间。临床发现胃肠道是对压力比较敏感的器官,人紧张焦虑和不安的情绪,可以反射到胃至上腹部疼痛,胃肠道疾病和焦虑关系密切，但胃肠道超敏反应、疼痛和及其相关的焦虑发生原因目前尚不完全明确。



近日，美国加州大学旧金山分校David Julius教授团队在期刊《nature》上发表题为“Gut enterochromaffin cells drive visceral pain and anxiety” 的研究型文章（图1）。
研究人员通过沉默或异位激活小鼠EC细胞来评估结肠感觉神经纤维活动、内脏敏感性变化，揭示EC细胞和粘膜传入物是肠易激综合征(IBS)等炎症或炎症后胃肠道(GI)疾病相关的内脏疼痛和焦虑的关键启动物。



图1
肠道由一层薄薄的上皮层排列，其中含有罕见但功能多样的肠内分泌细胞，这些细胞释放激素和神经递质，调节营养吸收、消化、运动、进食行为和感觉知觉。肠嗜铬(EC)细胞是肠内分泌细胞的一种独特亚型，可检测能够引起或加剧疼痛的环境和内源性刺激，包括饮食刺激物、微生物代谢物、炎症、机械性膨胀和应激相关激素和神经递质。EC可在受刺激后将血清素（5-羟色胺）释放到表达5-HT3受体的感觉神经末梢附近，再将痛觉信号传递到脊髓。

EC细胞促进肠道超敏反应

细菌来源的短链脂肪酸是肠内分泌细胞的激活剂，如异戊酸盐(ISV)升高后，会增强痛觉。研究表明，ISV可通过G蛋白偶联受体Olfr558激活EC细胞，在离体神经-肠道模型中产生依赖血清素的初级传入物机械敏感化。研究人员通过激活NaV1.8阳性感觉神经元确定ISV是否会引起神经纤维对其他非机械刺激敏感。他们将ISV应用于NaV1.8-ChR2雄性小鼠的体外神经-肠道，提高粘膜传入物对光的敏感性(图2a,b)，发现ISV介导的敏感性作用不是专门针对EC细胞或感觉神经元，而是更广泛地以一种性别二态的方式增强整个回路的兴奋性。
在NaV1.8-GCaMP6s小鼠肠内进行ISV给药致敏，来确定体内有多少神经元显示出基线活动 (图2d)。研究人员发现雌性小鼠基础神经元活动大大增加（图2e-h），这表明支配内脏靶器官（包括结肠）的神经元活动增强。在雄性小鼠中，6.5%的神经元被结肠内ISV激活，而在雌性小鼠中，对ISV敏感的细胞要少得多（2.2%）（图2e-i）。雄性小鼠的ISV反应被5-HT3受体拮抗剂阿洛司琼（ALS）给药后减弱（图2i），这与ISV引起EC细胞释放5-羟色胺，激活附近感觉神经末梢5-HT3受体的机制一致，而ALS并没有改变雌性小鼠对ISV敏感神经元的百分比（图2i）。为了进一步确定ISV是否增强了与疼痛相关的行为，研究人员测量了结肠内释放ISV对结直肠膨胀(CRD)的反射性运动作用(图2j)，发现ISV在一定范围内增强了雄性小鼠内脏运动反应(VMR)，这种行为效应在雌性小鼠中严重减弱 (图2l)。



图2
为了探究ISV的致敏作用是否由EC细胞特异性介导，他们利用破伤风毒素（TeNT）抑制突触囊泡融合和细胞神经递质释放的能力。通过交叉遗传学方法将TeNT靶向EC细胞。简单地说，是将有利于肠道内分泌细胞重组的Pet1Flp等位基因与Tac1Cre驱动结合使用（图3a）。在肠道中，Pet1Flp;Tac1Cre系会选择性地针对EC细胞（图3b）。为了验证TeNT的功能，他们使用亲电刺激物异硫氰酸烯丙酯（AITC）来激活EC细胞上的RPA1通道并刺激血清素释放。与TacCre对照组相比，研究人员观察到AITC诱发ECPFTox的血清素释放大幅减少（约30%）（图3c）。ECPFTox小鼠血清中的递质水平也同样下降（图3c），这说明EC细胞是外周血清素的主要来源。



图3
研究人员发现将ISV用于TacCre对照组动物的体外肠道神经，会增强感觉神经对粘膜机械刺激的反应，但在ECPFTox小鼠中没有观察到这种敏感作用（图3d）。这些发现证实，ISV的致敏作用是通过EC细胞介导的。与对照组相比，ECPFTox的VMR有所下降，尤其是在雌性小鼠中(图3e,f)。与体内外结果一致，ISV对雄性小鼠结肠的致敏作用在ECPFTox小鼠中消失 (图3g)。综上所述，这些结果表明EC细胞对内脏痛觉有很大的贡献。此外，沉默EC细胞对雌性影响更大，而在雄性中，ISV则有更大的诱发敏感作用。

性别依赖性内脏超敏反应

接下来，研究人员进一步探究EC细胞激活是否足以产生内脏超敏性。研究人员使用上述相同的转基因策略，将一个激活的DREADD受体（hM3Dq）表达在EC细胞中(图4a,b)。通过DREADD激动剂刺激EChM3Dq小鼠的肠道类器官，促进EC细胞激活和血清素释放(图4c)。他们发现，在DCZ治疗15分钟后，EChM3Dq雌性小鼠的血清素含量增加，并在30分钟后逐渐下降(图4c)。
DREADD激动剂会诱发EChM3Dq动物对粘膜机械刺激过度敏感，但不影响TacCre对照组动物(图4d)，这种敏感化在雄性中更为明显。为了研究内脏超敏性，研究人员在CRD前15分钟给EChM3Dq小鼠注射DREADD激动剂，发现雄性小鼠在一系列结肠压力下VMR显著增加，而雌性小鼠的VMR没有明显变化的趋势 (图4e)。使用ALS后会阻止DCZ介导的雄性小鼠VMR增强（图4f）。TacCre和EChM3Dq小鼠之间的结肠依从性没有明显差异。总的来说，性别差异与EC细胞-粘膜传入回路对雌性结肠敏感性发挥了更高的促进作用，因此增强的窗口更小。



图4

持续性内脏超敏反应

研究人员发现刺激EC细胞足以引起急性内脏超敏反应，但长时间的激活是否会产生类似于IBS的持续敏化反应? 为了解决这个问题，他们每天用DCZ治疗小鼠3周，并在停止激动剂治疗72小时后评估VMR对结肠扩张的影响（图4g）。与对照组相比，EChM3Dq动物在药物洗脱后保持了更高的敏感性，这表明EC细胞激活足以驱动急性和持续性内脏疼痛(图4h,i)。但这种研究仍需更长的时间确定这种“无结肠炎” 致敏范式是否代表真正的慢性(长期)疼痛模型。

黏膜纤维传递EC细胞信号

初级传入神经纤维终止于肠道的不同层，包括粘膜、肌肉和血管腔室以及肠系膜(图5a)。一般认为，对腹胀具有低阈值和高阈值(LT和HT)的神经纤维能驱动内脏疼痛，而不是对腹胀不敏感的粘膜传入神经纤维。然而，鉴于观察到EC细胞在介导疼痛反应中发挥的重要作用，研究人员想进一步探究EC细胞激活是否会影响支配黏膜的其他纤维。为了解决这个问题，研究人员使用了一种改良的离体神经-肠道模型。他们发现ECPFTox小鼠，VMR显示出对CRD减弱，在ISV治疗前后表现出正常的扩张敏感神经纤维激活（图5b）。EChM3Dq小鼠也是如此，其中CNO处理对膨胀敏感纤维没有影响（图5c）。总之，这些结果表明，内脏疼痛的调节是由对膨胀不敏感的粘膜传入物驱动的，这不是对局部组织变形做出反应，而是直接与粘膜层中的EC细胞相互作用而产生的。



图5

EC细胞活动调节焦虑

功能性胃肠道疾病通常与焦虑增加有关，这是复杂疼痛或感觉处理障碍的表现，可能会影响双向肠-脑信号。因此，研究人员通过观察小鼠在标准高架迷宫（EPM）中的行为，评估EC细胞慢性激活或抑制是否会影响焦虑状态。他们发现，接受DCZ治疗的未成熟EChM3Dq动物张开手臂的时间更少，表明焦虑感增加（图6）。更重要的是，联合使用ALS可逆转DCZ的作用(图6a)。综上所述，这些结果支持血清素EC细胞-粘膜传入信号在调节肠脑通讯紊乱和痛觉情感成分方面的作用，虽然不能排除EC细胞释放的血清素或其他递质的影响。有趣的是，ECPFTox动物张开的手臂的时间也较少（图6b），这表明通过长期抑制EC细胞的活动来扰乱消化道功能同样具有致焦虑作用。



图6

总结

结肠上皮细胞释放的介质可以引起或抑制内脏疼痛。这项研究表明，内脏疼痛和焦虑可以由一个非常小的肠内分泌细胞亚群驱动，即EC细胞，以及它们与粘膜传入物的相互作用来驱动。值得注意的是，粘膜传入物只对最小的粘膜变形刺激有反应，此前的研究并没有将其认定为内脏疼痛的关键驱动因素。这项研究强调了EC细胞-粘膜传入回路在内脏疼痛中的重要作用。
此外，这项研究增加了EC细胞对肠道功能的贡献，如机械感觉和化学感觉。EC细胞如何能承担这样的功能多样性？答案可能是它们所处的位置，以及与它们相互作用的神经元亚型，包括迷走神经、脊髓或肠道的神经元共同作用的结果。这项研究提出在EC细胞和粘膜传入细胞界面上释放局部血清素信号的作用，也表明初级传入神经纤维与肠内分泌细胞形成突触样的联系。阿洛司琼被批准用于治疗严重的IBS并伴有腹泻的妇女，这是通过抑制中枢或肠壁的高阈值神经感受器来发挥镇痛作用，本研究提出了一种新的机制来解释性别偏向的镇痛效应，可能是通过EC细胞-粘膜传入回路中调节血清素信号发挥作用。
功能性胃肠道疾病在女性中尤其普遍。基于本研究在体内外模型的数据，研究人员推测EC细胞粘膜传入信号在雌性小鼠和雄性小鼠的内脏疼痛中起着不同的作用，EC细胞通路可能在雌性小鼠中有更大的作用。同时，研究人员发现ISV或女性EC细胞的急性活化不能进一步增加内脏敏感性。因此，EC细胞传入电路的增强可能与雌激素等其他因素结合，使女性更容易发生内脏疼痛。功能性胃肠道疾病也与焦虑增加有关，研究人员在两性中都观察到焦虑增强与EC细胞抑制或激活有关，这表明这种综合行为状态是内脏失调的一种表现，突出了肠-脑轴在神经胃肠疾病中的重要性。

落小森

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