重磅升级！Blood+DIA技术特点完全解析

孔春

临床研究中，血液样本是重要的生物信息来源，而作为生命活动和生物功能的执行者，蛋白质是血液样本中最关键的信息大分子。但是，血液样本的复杂性为蛋白质组的研究带来巨大的困难，存在诸如高丰度蛋白含量占比高、动态范围大，蛋白种类复杂等问题，导致血液蛋白质组的研究存在巨大的挑战。
针对血液蛋白质组分析的难题，景杰生物在血液Blood+的基础上进一步升级为Blood+DIA血液蛋白质组高深度定量检测服务，对血液样品的样本前处理、色谱分离、质谱检测、数据分析等全流程 (图1) 进行了深度优化，提高了血液类样品的蛋白鉴定深度和定量重复性。今天我们邀请到景杰生物产品经理，对Blood+DIA中的技术特点进行完！全！揭！秘！



图1 Blood+DIA产品技术路线

1. 血液样本有什么特殊性？

血液是一种典型的富含高丰度蛋白的样本：
1）血液中存在很高的高丰度蛋白。例如，血液中排名第一的血清白蛋白 (HSA)，占据了全部蛋白含量的50%，而前22种蛋白的集合，更是占据了全部蛋白含量的99% (图2左)；剩下上千种蛋白加起来，只占了总含量的1%。而其中的低丰度蛋白往往才是疾病的特异性生物标志物 (biomarker) 或者药物作用的靶蛋白分子。
2）血液蛋白质含量的数量级跨度更大——可达10数量级，也就意味着有些蛋白含量很高，而有些蛋白的含量又极低。这种情况对仪器检测来说是巨大的挑战，几乎没有仪器能横跨如此大的检测范围。

3）截止目前，血液蛋白排名前300名的蛋白中已发现了70种不同疾病的biomarker，而300名之后的低丰度蛋白中却只发现了47种biomarker (图2右)，这表明血液的低丰度蛋白是未来发现潜在疾病biomarker的巨大宝库。



图2 (左) 血液中不同丰度蛋白的浓度和排名分布；(右) 血液中已发现的biomarker的排名分布

2. 为什么要去除高丰度蛋白？

去除血液中的高丰度蛋白是主流的血液前处理策略[1]。蛋白组的定量技术原理，是通过采集和解析肽段离子的二级谱图进行定性定量分析。通常，蛋白质谱检测存在最佳的样品上样量，一般为 1 μg 左右。因此，待检测样本中的高丰度蛋白越多，低丰度蛋白就越少，质谱中检测到的低丰度蛋白强度就越低。当去除高丰度蛋白后，相当于进入质谱检测的中低丰度蛋白提高了20倍 (通常抗体特异性试剂盒能去除95%的高丰度蛋白，相当于进入质谱检测的均为中低丰度蛋白)。因此能够显著提高中低丰度蛋白的信号强度(实测可提升2-20倍，下图)，并大幅提升血液蛋白的鉴定数量 (65%) 和蛋白的定量重复性 (Pearson=0.99，生物学重复CV<20% )。



图3 去除高丰度蛋白能够显著提高进入质谱进行分析的低丰度蛋白含量



图4 去除高丰度蛋白能显著提升低丰度蛋白信号同时提升血液蛋白组数据质量

3. 如何去除高丰度蛋白？

去除高丰度蛋白可分为非特异性去除 (如利用纳米磁球) 和特异性去除 (抗体试剂盒) 两类。其中主流方式是采用基于抗体的去高丰度蛋白试剂盒进行去除，其原理为利用免疫亲和技术，高效高特异性地除去血清血浆中的高丰度蛋白，从而降低高丰度蛋白干扰 (下图)。
景杰生物目前采用的去高丰度试剂盒可以特异性去除血液中排名前14位的高丰度蛋白，约占总蛋白含量的95%，并有严格的质控，保证实验成功。



图5 通过SDS-PAGE严格质控验证高丰度蛋白去除效果
4. 4D检测与淌度分离是什么？

针对血液的理化特性，Blood+DIA技术基于最先进的Thermo Fisher Scientific公司的Orbitrap Exploris™ 480 coupled with FAIMS Pro (field asymmetric ion mobility spectrometry, 高场非对称波形离子迁移谱) 质谱仪器，引入淌度分离实现4D检测，降低干扰提升检测灵敏度。
FAIMS pro接口是一种气态的离子过滤装置，通过电场的作用可以使得部分中性离子被偏转出去 (一般为非肽段，如糖类、脂质、核酸等)，从而降低样品的复杂度，有利于后续质谱对肽段的检测。根据实际测试的结果，通过FAIMS pro装置可进一步过滤筛选干扰信号，提升血液鉴定深度的同时保持良好的定量稳定性。



图6 FAIMS pro接口工作原理图

5. 为什么选择DIA技术路线？

DIA (Data Independent Acquisition，数据非依赖性采集模式) 蛋白定量技术，其原理是通过选择特定区间内所有的肽段母离子，碎裂后利用母离子或二级离子的峰面积进行定量。与DDA相比，DIA具备缺失值少，批次效应小，重复性好等优势，如下图所示，项目实测 (155个血液样本) 数据显示，Blood+DIA技术结合了优化的前处理策略、4D平台与DIA技术的优点，具备高通量、高稳定性的技术特性，特别适合大规模临床样品的研究。



图7 Blood+DIA大队列样本项目实测

6. 为什么选择Swiss-Prot数据库？

Swiss-Prot数据库是高质量、经过专家手工注释、非冗余的蛋白序列库，拥有最广泛的文献证据，也是目前高分文章使用的权威数据库。通常，使用不同类型的蛋白数据库，得到的蛋白数量存在较大的差别。经过测试，血浆样品1000+的数据 (利用Swiss-Prot数据库)，如果换用UniProtKB数据库，可以鉴定到多达3000+的蛋白数目 (绝大部分增加的蛋白为免疫球蛋白变体、Uncharacterized protein和重复序列的蛋白碎片)。因此，抛开数据库讨论血液蛋白鉴定数目，就类似抛开剂量谈毒性，没有太大的意义。景杰生物选择Swiss-Prot数据库，具有极高的可靠度且蛋白注释全面，如蛋白功能、结构域、翻译后修饰和变体等，更加适合后续的生物学验证并适配临床转化应用。



图8 不同来源蛋白数据库的关系



经过全流程优化，景杰生物Blood+DIA相比于传统的方法有一系列的优势。相比于传统TMT的方法，其不受制于标记通道数的限制，适用性更加广泛，批次效应更小；相比于传统的DDA方法，DIA的定量稳定性更好；相比于不去高丰度的传统DIA方法，其在实现蛋白组深度覆盖的同时还能进一步提高定量重复性。
景杰生物Blood+DIA特别适合于大规模体液队列样本的高通量高稳定性分析，结合权威的Swiss-Prot和强大的机器学习的应用，能够为分子机制发现、血液标志物筛选、药物靶点发现和临床转化应用提供新的强大工具。



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参考文献
1. Geyer PE, et al. 2017. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Mol Syst Biol.
2. Meier F, et al.2020. diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation
combined with data-independent acquisition. Nat Methods.
3. Ludwig C, et al. 2018. Data-independent
acquisition-based SWATH-MS for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst
Biol.
4. Collins BC, Hunter
CL, Liu Y, et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative
and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nat Commun.

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