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中大量血液DNA提取的操作步骤有哪些?

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发表于 2023-3-6 08:08:02 | 显示全部楼层 |阅读模式
操作步骤(请自备:无水乙醇、异丙醇、1.5mL 灭菌离心管、生理盐水)
1. 取出洗涤液,按终浓度 70%比例加入无水乙醇,如 3mL 加入 7mL 无水乙醇,9mL 加入 21mL 无水乙醇,充分混匀;
2. 取 1.5mL 离心管 1 支,加入 1mL 已经解冻或新鲜的血液(冷藏血液需先轻振混匀后再加入),再加入 70μL 结合液,充分振荡 15 秒,室温放置 5 分钟,13,000rpm 离心 5 分钟;
3. 彻底吸弃上清,加入 0.8mL 生理盐水,振荡至管底沉淀彻底分散,无结块,13,000rpm 离心 5 分钟(注意将管盖、管壁粘附的血迹洗净);
4. 彻底吸弃上清,加入 0.2mL 生理盐水,振荡至管底沉淀彻底分散,无结块,再加入 180μL 裂解液、20μL 消化液,振荡混匀,65℃水浴10 分钟;[注意:如需除去 RNA,可在加入裂解液后先加入 20μL BIOG DNase –Free RNase A(货号:51006),振荡混匀,室温放置 5 分钟。再加入20μL 消化液,振荡混匀,65℃水浴 10 分钟。]
5. 取出离心管,放置到室温,3,000rpm 离心 30 秒,加入 0.4mL 异丙醇,轻轻颠倒混匀 8 次,如有半透明悬浮物,不影响 DNA 的提取与后续实验;
6. 将吸附柱放入收集管内,将上述溶液转入吸附柱内,13,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液;
7. 将吸附柱放回收集管内,加 600μL 洗涤液至吸附柱内,静置 2 分钟,13,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液;
8. 将吸附柱放回收集管内,13,000 rpm 离心 2 分钟,离去残留的洗涤液。同时,按每份样本 40μL 取洗脱液(如 10 份提取样本,即取 400μL洗脱液),放置于灭菌 1.5mL 离心管,65℃预热。
9. 取出吸附柱,放入新的 1.5 mL 灭菌离心管内,在吸附柱中心加入 40 μL 预热洗脱液,静置 2 分钟,13,000 rpm 离心 1 分钟,收集 DNA溶液。提取的 DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。
注意事项:
1. 裂解液、洗涤液、结合液含有刺激性化学物质,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻。
2. 洗涤液在使用前应加入乙醇后充分混匀,最好现用现配,每次根据所要提取的样本量计算后适量配制。
3. BIOG Medi Blood DNAIsolate Kit 设定的标准提取血量为 1mL,客户如改变提取血量,请同比例增减结合液、裂解液和消化液的使用量,洗涤液的量建议不低于 500μL,洗脱液的量客户可根据对 DNA 浓度的要求进行选择,最低可使用 20μL 洗脱液。
4. 裂解液如有白色絮状物析出属正常现象,置于 37℃水浴中溶解即可。
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